原核蛋白表达实验操作实例_pSumo-mut系统

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原核蛋白表达实验案例--pSumo-Mut质粒+Arctic Express宿主菌低温表达体系

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pSumo-Mut质粒+Arctic Express宿主菌低温表达体系

实验描述
利用基因合成、cDNA克隆、反转录等方法，取得目的基因，将目的基因亚克隆至表达载体pSumo-Mut，目的基因在N端融合Sumo标签蛋白，顺利获得测序和酶切验证，确证取得亚克隆正确的表达质粒。　　利用构建好的表达质粒，转化Arctic Express宿主菌，在11度低温IPTG诱导条件下，SDS-PAGE检测目标蛋白表达情况，确认蛋白分布在上清或是沉淀中。　　如果目标蛋白产物分布与上清中，顺利获得Ni柱亲和纯化，取得目的蛋白；如果目标蛋白分布于沉淀中，则顺利获得包涵体梯度洗脱后，重溶取得目标蛋白，必要的话，重溶蛋白在进一步顺利获得亲和纯化提高纯度。　　纯化后的蛋白经过Sumo蛋白酶酶切，蛋白N端将会彻底裸露，不留任何氨基酸残基，酶切后的混合物经Ni柱亲和纯化，可以去除融合蛋白、Sumo标签蛋白和Sumo蛋白酶，剩余的蛋白即为酶切后目的蛋白。
测序验证

序列比对

重组质粒酶切
		Marker：250,500,750,1000,1500,2000,3000,5000 基因名称：XXXX 克隆编号：G1XXX-1 酶切鉴定：BamHI/HindIII OD260/OD280： 1.85
蛋白表达分析鉴定（11度低温诱导体系）
	蛋白诱导表达鉴定	泳道M：蛋白marker 泳道1：诱导前泳道2：诱导后全菌（克隆子1）泳道3：诱导后全菌（克隆子2）泳道4：诱导后沉淀泳道5：诱导后上清
重组蛋白亲和纯化（Ni亲和树脂一步亲和纯化）
	蛋白Ni-IDA柱亲和纯化	泳道M：蛋白Marker 泳道1：诱导后上清泳道2：流出液泳道3：洗脱液
纯化后蛋白Sumo蛋白酶酶切
	蛋白Sumo蛋白酶酶切	泳道M：蛋白Marker 泳道1：纯化后融合蛋白泳道2：2ug融合蛋白/2U sumo蛋白酶切泳道3：2ug融合蛋白/1U sumo蛋白酶切泳道4：2ug融合蛋白/0.5U sumo蛋白酶切
Sumo蛋白酶酶切后第二次亲和纯化
	Sumo蛋白酶酶切后第二次亲和纯化	泳道M：蛋白Marker 泳道1：融合蛋白酶切后混合物泳道2：流出液泳道3：洗脱液
备注：上述实验图片是腾博tengbo9885官网生物技术有限公司原核蛋白表达实验的标准交付图片，具体的订单双方协商确认。