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  昆虫细胞培养是杆状病毒表达的关键步骤，本文总结了昆虫细胞培养最常见的问题，包括Sf9/Sf21/H5细胞。细胞形态变化或生长率改变表明潜在细胞问题。在平时的实验中养成记录细胞活率和倍增时间的习惯将有助于腾博tengbo9885官网解决出现的问题。

问题	可能原因	解决方法
贴壁细胞：形态变化-第一周培养
细胞呈粒状或复苏后漂浮	没有在细胞复苏后1h移除旧培养基。DMSO在培养基中对细胞有害。	移除旧液，加入新液。
	H5细胞未能在培养基中复苏。	细胞适应几天。保持观察细胞。如果可以则可换成其他培养基。
	细胞表现出血清敏感性。	试用新型或批号血清，重新复苏细胞。
细胞裂解或形成碎片，活率和生长率降低	细胞传代超过30代。	复苏代次较低的新细胞。
	野毒或重组杆状病毒污染。	换掉旧培养基然后使用新鲜培养基。
	能观察到细胞的裂解碎片和/或鼓胀。核心内容物指示野生型感染。	①复苏新细胞； ②净化层流罩和相关设备； ③配制新培养基。
	传代中机械力过大。	复苏新细胞 换一种传代的方法（如:脱落）
悬浮物（＞10%培养基中的细胞）	在形成融合单层之前传代太频繁。	①移除培养基/悬浮物； ②换新鲜培养基； ③在形成融合单层后再传代。
	细胞过度生长。	①如果是第一次发生需更换培养基和均分细胞； ②如果经常发生则需重新复苏细胞。
	对新批次或品牌血清敏感。	使用其他血清。
贴壁细胞：形态变化-培养一周后
细胞鼓胀，核内有斑点	野毒或重组杆状病毒污染。	换掉旧培养基然后使用新鲜培养基。 ①复苏新细胞； ②配制新培养基； ③净化相关设备。
贴壁细胞：生长和/或活率降低
细胞倍增时间＞24h	传代方法太严格。	重新复苏细胞然后用其他传代方法（如：脱落）。
	细胞生长过度一次。	重新复苏细胞然后每天观察细胞避免过度生长。
	细胞处于高代次（高于30代）。	重新复苏细胞确保复苏细胞是低代次（少于10代）。
	细胞在融合前频繁传代。	①细胞形成融合后再传代； ②如果倍增时间没有增长，则复苏新细胞。
	细胞反复在低于20%融合时频繁传代。	浓缩细胞使融合达到50%或更高然后传代。
细胞活率低于90%	传代方法太严格。	重新复苏细胞然后用其他传代方法（如：脱落）。
	细胞融合前贴壁较紧频繁传代需较大的机械力。	①细胞形成融合后再传代； ②如果活率没有增长，重新复苏细胞。
	杆状病毒或真菌污染。	换掉旧培养基然后换新鲜培养基； ①净化相关设备； ②准备新鲜培养基。
	野毒或重组杆状病毒污染。可见细胞裂解、碎片和/或细胞鼓胀。核内容物表明野生型感染。	①净化相关设备； ②准备新鲜培养基； ③保持培养细胞培养基和培养病毒的培养基分开放置； ④在层流罩下不能同时进行细胞培养和病毒培养工作。
悬浮培养：生长和/或活率降低
倍增时间＞24h	悬浮移植或分得细胞密度过低（少于5×105细胞/mL）。	浓缩细胞至1×106细胞/mL。这样会促使细胞达到对数生长状态。
	悬浮培养过度密度＞3×106细胞/mL。	①分植细胞密度达到1.5×106细胞/mL； ②过夜生长密度达到2.5×106-3.0×106细胞/mL； ③分植使浓度达1.0×106细胞/mL，继续正常培养。
	通风不良。	①培养液体积不宜超过摇瓶容积的1/2； ②培养基体积接近最小要求体积； ③叶轮旋转流畅。急动颠簸则通风不良。
细胞活率低于90%	叶轮旋转剪切力。
	杆状病毒或真菌污染。	换掉旧培养基然后使用新鲜培养基。 培养基加抗生素。
	野毒或重组杆状病毒污染。	换掉旧培养基然后使用新鲜培养基。
	可见细胞裂解、碎片和/或细胞鼓胀。核内容物表明野生型感染。	在能触及杆状病毒的地方要求使用完全无菌的摇瓶。
H5 悬浮培养中的问题
细胞聚团	细胞生长密度高于 2×106-2.5×106细胞/mL。	① 将 摇 瓶 在 层 流 罩 下 静30-45min 使聚团沉淀； ②移出含有小簇细胞和单个细胞的上 1/3 培养基置于新摇瓶继续培养
	旋转速率过低。	用 80-90rpm。
	适应未成功。	重试，初次尝试较常见。 如果没有加肝素，则加肝素
细胞裂解或形成碎片	陈旧细胞悬浮培养超过 2月。	重新复苏代次较低的细胞，然后开始新的悬浮培养。
	叶轮转动不畅。	调整摇瓶叶轮使其转动顺畅。

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