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motif文库筛选实验流程

1.对照实验

1.1 取Y187 酵母菌株在YPDA 固体培养基上划线，30℃倒置培养2-3 天;

1.2 挑取直径2-3 mm 的单克隆于3 ml YPDA 培养液中，30℃，250 rpm 摇床培养8 h;

1.3 吸取2-5 μl至50 ml YPDA 中（250 ml 三角瓶），30℃，23-250 rpm 摇床培养16-20 h，直至OD600 达到0.15-0.3;

1.4 将菌液平均分到两个50 ml 的离心管中，室温，700×g，5 min，去除上清，用新鲜的100 ml 培养液重新悬浮菌体，30℃，230-250 rpm，培养3-5 h，至OD600值为0.4-0.5 h;

1.5 室温700×g 离心5 min 以收集菌体，倒去上清并用60 ml 无菌去离子水重悬酵母菌;

1.6 室温700×g 离心5 min 以收集菌体，倒去上清并用3 ml；1.1×TE/LiAc/H2O溶液重悬酵母；同时将Carrier DNA 预变性两次；

1.7 高速离心15 s，去除上清，加入600 μl1.1×TE/LiAc/H2O溶液吹打均匀，即制备好酵母感受态，备用；

1.8 取酵母感受态50 μl，加入10 μl预变性的Carrier DNA，和以下质粒各200 ng，轻轻混匀；
阳性对照：p53HIS2 and pGAD-Rec2-53
阴性对照：pHIS2 and pGAD-Rec2-53

1.9 加入300 μl 1×TE/LiAc/PEG，混匀；

1.10 30℃水浴30 min，每10 min 摇匀一次；

1.11 每管加入20 μl DMSO，轻轻混匀；

1.12 42℃水浴热激15 min，每5 min 上下颠倒混匀一次；

1.13 高速离心15 s，弃上清。用1 ml YPD Plus 重悬菌体，30℃，250 rpm 复苏1h；

1.14 高速离心15 s，弃上清；

1.15 100 μlNaCl (0.9％)重悬菌体，涂布于以下平板：
· SD/-Trp
· SD/-Leu
· SD/-Leu/-Trp (DDO)
· SD/-His/-Leu/-Trp//50 mM 3-AT (TDO + 3-AT)

1.16 30℃培养箱培养3-5 天。

1.17 预期结果：
阳性对照：DDO 板上正常生长，TDO + 3-AT 板上正常生长
阴性对照：DDO 板上正常生长，TDO + 3-AT 板上不生长

2. 诱饵自激活检测

2.1 取Y187 酵母菌株在YPDA 固体培养基上划线，30℃倒置培养2-3 天；

2.2 挑取直径2-3 mm 的单克隆于3 ml YPDA 培养液中，30℃，250 rpm 摇床培养8 h；

2.3 吸取2-5 μl至50 ml YPDA 中（250 ml 三角瓶），30℃，23-250 rpm 摇床培养16-20 h，直至OD600 达到0.15-0.3；

2.4 将菌液平均分到两个50 ml 的离心管中，室温，700×g，5 min，去除上清，用新鲜的100 ml 培养液重新悬浮菌体，30℃，230-250 rpm，培养3-5 h，至OD600值为0.4-0.5 h；

2.5 室温700×g 离心5 min 以收集菌体，倒去上清并用60 ml 无菌去离子水重悬酵母；

2.6 室温700×g 离心5 min 以收集菌体，倒去上清并用3 ml ；1.1×TE/LiAc/H2O溶液重悬酵母；同时将Carrier DNA 预变性两次；

2.7 高速离心15 s，去除上清，加入600 μl 1.1×TE/LiAc/H2O溶液吹打均匀，即制备好酵母感受态，备用；

2.8 取酵母感受态50 μl，加入10 μl预变性的Carrier DNA，和诱饵质粒200 ng，轻轻混匀；

2.9 加入300 μl 1×TE/LiAc/PEG，混匀；

2.10 30℃水浴30 min，每10 min 摇匀一次；

2.11 每管加入20 μl DMSO，轻轻混匀；

2.12 42℃水浴热激15 min，每5 min 上下颠倒混匀一次；

2.13 高速离心15 s，弃上清。用1 ml YPD Plus 重悬菌体，30℃，250 rpm 复苏1h；

2.14 高速离心15 s，弃上清，重悬菌体；

2.15 别涂布100 µl菌液于以下培养基
·SD/-Leu
·SD/-His/-Leu
·SD/-His/-Leu/20 mM 3-AT
·SD/-His/-Leu/30 mM 3-AT
·SD/-His/-Leu/40 mM 3-AT
·SD/-His/-Leu/60 mM 3-AT
·SD/-His/-Leu/80 mM 3-AT
·SD/-His/-Leu/100 mM 3-AT

2.17 30℃培养3 d。根据菌落生长情况，选择合适的3-AT抑制浓度用于后续实验。如果3-AT浓度调整到100 mM仍然不能抑制生长，则该诱饵基因不适用于Y187酵母单杂体系

3.文库筛选

3.1 确认Bait 无自激活无毒性后，将Y187酵母菌株在YPDA 固体培养基上划线，30℃培养箱倒置培养2 - 3 天；

3.2 挑取直径2-3 mm 的单克隆于3 ml YPDA 培养液中，30℃，250 rpm 摇床培养8 h；

3.3 吸取2-5 μl至50 ml YPDA 中（250 ml 三角瓶），30℃，23-250 rpm 摇床培养16-20 h，直至OD600 达到0.15-0.3；

3.4 将菌液平均分到两个50 ml 的离心管中，室温，700×g，5 min，去除上清，用新鲜的100 ml 培养液重新悬浮菌体，30℃，230-250 rpm，培养3-5 h，至OD600值为0.4-0.5；

3.5 室温700×g 离心5 min 以收集菌体，倒去上清并用60 ml 无菌去离子水重悬酵母菌；

3.6 室温700×g 离心5 min 以收集菌体，倒去上清并用3 ml 1.1×TE/LiAc溶液重悬酵母；同时将Carrier DNA 预变性两次；

3.7 高速离心15 s，去除上清，加入600 μl 1.1×TE/LiAC溶液吹打均匀，酵母感受态即制备好；

3.8 加入50 μl预变性的Carrier DNA，5μg 诱饵质粒，20μgHIS2-Motif(8N)质粒，轻轻混匀；

3.9 加入2.5 ml 1×TE/LiAc/PEG，混匀；

3.10 30℃水浴45 min，每15 min 摇匀一次；

3.11 加入160 μl DMSO，轻轻混匀；

3.12 42℃水浴热激20 min，每10 min 上下颠倒混匀一次；

3.13 700×g 离心5 min，弃上清。用3 ml YPD Plus 重悬菌体，30℃，250 rpm 复苏1.5 h；

3.14 700×g 离心5 min，弃上清；

3.15 加入0.9％NaCl悬浮菌体，至终体积6 ml 左右，取100 μl 1/10、1/100 稀释液涂布100 mm SD/-Leu/-Trp平板，用于计算转化效率

3.16 其余菌液涂布于TDO/3-AT 平板上，150 μl /块，约50 块；在30℃恒温培养箱培养3 - 5 天，单克隆长出至大小1 - 2 mm，初筛完成；

3.17 将初筛平板上阳性克隆转移到二次筛选培养基TDO/3-AT 上，进行高严谨度筛选；

3.18 挑取生长较大的阳性克隆进行PCR 鉴定，扩增产物顺利获得琼脂糖凝胶电泳检测；

3.19 进行酵母阳性克隆质粒抽提及扩增大肠；

3.20 提取大肠质粒并送测，判读互作motif序列。

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